Полимеразная цепная реакция

Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) в экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

[править] История

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК в синтетических праймеров^[1]. Однако, в то время эта идея осталась нереализованной. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science^[2]) Через 8 лет после этого, за изобретение метода ПЦР, К.Муллис получил Нобелевскую премию^[3].

В начале использования метода после каждого цикла нагревания в охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий^[4]. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Кэри Маллис работал химиком-синтетиком (он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точковых мутаций по гибридизации с геномной ДНК) в компании Цетус (en:Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С.Городецким в 1980 году^[5], а также, за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году, в американскими биохимиками Alice Chien, David B.Edgar и John M. Trela.^[6] В связи с этим компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент^[7]. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.

[править] Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp^[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20в40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований^[9].

[править] Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза в фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов в Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции в рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию^[10].

[править] Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18в30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг^[11]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).

Важнейшая характеристика праймеров в температура плавления (T_m) комплекса праймер-матрица.

T_m в температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Температуру плавления можно приблизительно определить по формуле

$T_m = 77.1 + 11.7\log_{10} (K^+) + 0.41(GC%) - 528/L$ , где L в количество нуклеотидов в праймере, K⁺ молярная концентрация ионов калия, GC% процентный состав гуанина и цитозина в праймере (GC-состав).

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

GC-состав ~ 40в60 %;
близкие T_m праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
отсутствие неспецифических вторичных структур в шпилек^[12] и димеров^[13];
желательно, чтобы на 3в™-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

[править] Амплификатор

Рис. 1: Амплификатор для проведения ПЦР

ПЦР проводят в амплификаторе в приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

[править] Ход реакции

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (первый и последний слоты) и продукты ПЦР-реакции.

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20в35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2).

[править] Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5в2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-3 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

[править] Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига в 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

[править] Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это в стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7в10 мин.

Рис. 2: Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94в96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2ⁿ в 2n, где n в число циклов реакции^[14]. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)ⁿ, где P в количество продукта, Е в средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».

[править] Разновидности ПЦР

Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) в применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) в используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) в используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) в проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является англ. Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой (температурой плавления), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов^[15].
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени в используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или пробы для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I, который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения в при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I при длине волны 521 нм (зелёный) Fluorescence SpectraViewer.
Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) в с помощью этого метода уменьшают влияние не специфического связывания праймеров на образование ПЦР продукта. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Праймер связывается с комплементарной ДНК мишенью, но с меньшей эффективностью и при температуре плавления праймера, выше оптимальной (температуре плавления это равновесие между количеством связанных с ДНК мишенью и свободных праймеров, в растворе). При температуре отжига выше оптимальной, праймер связывается с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер стабилен при комплементарности на половину свой длины, что приводит к образованию неспецифического ПЦР продукта. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем снизить до оптимальной, например до 60-65°С.
Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) в акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR).
ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) в модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых в Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая в ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимераза берётся в 25-100 раз больше по отношению к Pfu полимеразе.
RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК в используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.
Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) в ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является в уникальная ПЦР (англ. unique PCR), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.
ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR) в модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела небольшими молекулами типа Affibody, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут, в этом случае.
Виртуальная ПЦР (англ. in silico PCR, цифровая ПЦР, электронная ПЦР) относится к вычислительным средствам для расчета теоретической ПЦР с помощью списка праймеров (или проб) для предсказания возможного ПЦР продукта и участков связывания праймеров на исследуемом геноме или хромосомы, или на кольцевых молекулах ДНК или любом другом участке ДНК.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: вATHв, где Н в А, Т или С.

[править] Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

[править] Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления в кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически в одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).

[править] Установление отцовства

Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребёнок. (3) Мать. Ребёнок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков (рис. 3). Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

[править] Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

[править] Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого в отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого в менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства.^{[источник не указан 922 дня]} Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).

[править] Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) в это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого паллетного количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор в фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена в РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Рис. 4: Клонирование гена с использованием плазмиды.
(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.

[править] Секвенирование ДНК

Основная статья: Секвенирование

В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

[править] Мутагенез

Основная статья: Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

[править] См. также

[править] Примечания

в‘ Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNAв™s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341в361. PMID 4927950
в‘ Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
в‘ Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г. (англ.)
в‘ R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. in: Science. 239.1988, 487в491. ISSN 0036-8075 PMID: 2448875
в‘ Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. в 1980. в T. 45. в C. 644в651.
в‘ Alice Chien, David B.Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550в1557.
в‘ Roche в Roche announces settlement agreement with Promega
в‘ 1 kbp (kilo base pair (англ.)) в 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК
в‘ Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
в‘ http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php
в‘ Отжиг (англ. annealing) в гибридизация фрагментов ДНК
в‘ Шпилька в внутримолекулярная самокомплементарная структура
в‘ Димер в межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой
в‘ Календарь РН, Сиволап ЮМ (1995). «Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами». Биополимеры и клетка 11 (3-4): 55-65. ISSN 0233-7657.
в‘ Pierce KE and Wangh LJ (2007). «Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells». Methods Mol Med. 132: 6585. DOI:10.1007/978-1-59745-298-4_7. PMID 17876077.

[править] Литература

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. в М.: Мир, 2002. в 589 с., илл. в ISBN 5-03-003328-9
Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. в М.: Наука, 2005. в В 2 т. в ISBN 5-02-033278-X
Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. в Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. в 496 с.; илл. в ISBN 5-94087-098-8
Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Java web tools for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis. Genomics, 98(2): 137в144. http://primerdigital.com/tools/

[править] Ссылки

[0] в‘ Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNAв™s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341в361. PMID 4927950

[1] в‘ Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.

[2] в‘ Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г. (англ.)

[3] в‘ R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. in: Science. 239.1988, 487в491. ISSN 0036-8075 PMID: 2448875

[4] в‘ Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. в 1980. в T. 45. в C. 644в651.

[5] в‘ Alice Chien, David B.Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550в1557.

[6] в‘ Roche в Roche announces settlement agreement with Promega

[7] в‘ 1 kbp (kilo base pair (англ.)) в 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК

[8] в‘ Venter J, et al. (2001). «The sequence of the human genome». Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995

[9] в‘ http://www.biofidal.com/biofidal2/cat/2/pyro.php

[10] в‘ Отжиг (англ. annealing) в гибридизация фрагментов ДНК

[11] в‘ Шпилька в внутримолекулярная самокомплементарная структура

[12] в‘ Димер в межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой

[0233-7657-13] в‘ Календарь РН, Сиволап ЮМ (1995). «Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами». Биополимеры и клетка 11 (3-4): 55-65. ISSN 0233-7657.

[Pierce_and_Wangh-14] в‘ Pierce KE and Wangh LJ (2007). «Linear-after-the-exponential polymerase chain reaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid, reliable diagnosis from single cells». Methods Mol Med. 132: 6585. DOI:10.1007/978-1-59745-298-4_7. PMID 17876077.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

Полимеразная цепная реакция

Содержание

[править] История

[править] Проведение ПЦР

[править] Компоненты реакции

[править] Праймеры

[править] Амплификатор

[править] Ход реакции

[править] Денатурация

[править] Отжиг

[править] Элонгация

[править] Разновидности ПЦР

[править] Применение ПЦР

[править] Криминалистика

[править] Установление отцовства

[править] Медицинская диагностика

[править] Персонализированная медицина

[править] Клонирование генов

[править] Секвенирование ДНК

[править] Мутагенез

[править] См. также

[править] Примечания

[править] Литература

[править] Ссылки

Личные инструменты

Пространства имён

Варианты

Просмотры

Действия

Поиск

Навигация

Участие

Печать/экспорт

Инструменты

На других языках